Grupa badawcza - dr Małgorzata Czystowska-Kuźmicz
Nasze badania koncentrują się na poznaniu wpływu małych mikropęcherzyków zewnątrzkomórkowych/egzosomówna komórki układu immunologicznego, w szczególności w kontekście rozwoju choroby nowotworowej. Badamy w jaki sposób komórki nowotworowe za pośrednictwem egzosomów hamują odpowiedź immunologiczną i jak to wpływa na ewentualną immunoterapię. Badając ilościowo i jakościowo egzosomy w materiale biologicznym od pacjentów z chorobą nowotworową, próbujemy ustalić ich znaczenie diagnostyczne lub prognostyczne jako tzw. „liquid biopsy”. Ponadto badamy immunosupresyjne mechanizmy indukowane przez mikropęcherzyki inkubując in vitro komórki układu immunologicznego z egzosomami oraz prowadząc badania w mysich modelach nowotworów.
Badania naukowe:
- Optymalizacja metod izolacji mikropęcherzyków/egzosomów z materiału biologicznego od pacjentów (osocze, płyn z otrzewnej, płyn z płukania oskrzelowo-pęcherzykowego) pod kątem ich identyfikacji jako biomarkerów nowotworowych: metody chromatografii wykluczenia (ang. Size exclusion chromatography, SEC), izolacji immunomagnetycznej
- Wdrażanie i optymalizacja nowoczesnych metod badania mikropęcherzyków/egzosomów: fluorescencyjna metoda analizy śledzenia nanocząstek (ang. Fluorescence Nanoparticle Tracking Analysis, FL-NTA), cytometria przepływowa z użyciem kulek opłaszczonych przeciwciałami dla markerów egzosomalnych
- Wpływ mikropęcherzyków na metabolizm aminokwasów w mikrośrodowisku guza w raku jajnika
- Rola mikropęcherzyków jako nośników cząsteczek tzw. punktów kontrolnych układu immunologicznego (ang. immune checkpoints) w supresji odpowiedzi przeciwnowotworowej
- Zależność między indywidualnym profilem molekularnym mikropęcherzyków a stopniem immunosupresji pacjentów z niedrobnokomórkowym nowotworem płuc
- Wpływ mikropęcherzyków na immunoterapie, w szczególności terapie z zastosowaniem inhibitorów punktów kontrolnych
Sylwetka kierownika zespołu:
Małgorzata Czystowska-Kuźmicz ukończyła Wydział Biologii Uniwersytetu im. Heinrich-Heine w Düsseldorfie (Niemcy) w 2001. Następnie odbyła studia doktoranckie i otrzymała stopień doktora nauk biologicznych w Laboratorium Molekularno-Genetyczne Oddziału Położniczo-Ginekologicznego Kliniki Uniwersyteckiej w Düsseldorfie w 2006 roku. W latach 2006-2010 przebywała jako post-doc w jednym z czołowych laboratoriów zajmujących się badaniem mikropęcherzyków w University of Pittsburgh Cancer Institute (Stany Zjednoczone) pod kierownictwem prof. Theresy Whiteside. Po urlopie wychowawczym w 2013 rozpoczęła pracę w Zakładzie Immunologii Warszawskiego Uniwersytetu Medycznego w ramach multidyscyplinarnego projektu BASTION (From Basic to Translational Research in Oncology, 2013-2015). Następnie utworzyła w Zakładzie Immunologii własną grupę badawczą realizującą projekty finansowane przez Narodowe Centrum Nauki oraz Narodową Agencję Wymiany Akademickiej (NAWA). W 2019 roku przeniosła się do Katedry i Zakładu Biochemii WUM, gdzie kontynuuje prace badawcze.
Zespół:
Doktoranci:
mgr inż. Magdalena Długołęcka
Od 2019 roku jest uczestniczką Szkoły Doktorskiej Warszawskiego Uniwersytetu Medycznego, stypendystą w zespole dr Małgorzaty Czystowskiej-Kuźmicz w projekcie “Profil molekularny egzosomów znajdujących się w płynie z płukania oskrzelowo-pęcherzykowego jako nowy biomarker upośledzenia odpowiedzi immunologicznej w niedrobnokomórkowym raku płuca” finansowanym z Narodowego Centrum Nauki w konkursie Opus. Zajmuje się izolacją i charakteryzacją małych pęcherzyków zewnątrzkomórkowych z podejrzeniem Niedrobnokomórkowego Raka Płuca. Pęcherzyki izoluje z osocza pacjentów (metoda Size Exclusion Chromatography,SEC) oraz z płynu z płukania oskrzelowo-pęcherzykowego (ultrawirowanie). Główne techniki jakie wykorzystuje w celu charakteryzacji pęcherzyków to fluorescyjne śledzenie nanocząstek (ang. fluorescent NanoTracking Analysis,FL-NTA), cytometria przepływowa z wykorzystaniem kulek magnetycznych oraz Western Blot i Elisa.
m
gr inż. Karolina Soroczyńska
O
Studenci:
le
k. Łukasz Zaręba
Od 2020 roku jest stypendystą w zespole dr Małgorzaty Czystowskiej-Kuźmicz w projekcie “Profil molekularny egzosomów znajdujących się w płynie z płukania oskrzelowo-pęcherzykowego jako nowy biomarker upośledzenia odpowiedzi immunologicznej w niedrobnokomórkowym raku płuca” finansowanym z Narodowego Centrum Nauki w konkursie Opus. Zajmuje się izolacją i charakteryzacją małych pęcherzyków zewnątrzwydzielniczych (EVs) pochodzących od pacjentów z podejrzeniem niedrobnokomórkowego raka płuca wykorzystując metody takie jak SEC, izolacja poprzez ultrawirowanie oraz NTA. Od 2021 roku uczestnik Szkoły Doktorskiej Warszawskiego Uniwersytetu Medycznego. W swoim projekcie doktoranckim zaangażowany jest w badania na modelach mysich w których wykorzystuje metody Immunohistochemii oraz Western Blot.
Technicy: Iwona Rosa
Byli współpracownicy:
Samodzielni naukowcy: dr hab.Marta Szajnik
Postdocy: dr Magdalena Grażul
Technicy: mgr. Zuzanna Homoncik
Studenci: mgr inż. Jacek Szymański
Aktualne projekty:
Udział pecherzyków zewnątrzkomórkowych oraz egzosomalnej arginazy w dysfunkcji układu immunologicznego w endometriozie
Opus, Narodowe Centrum Nauki, lata realizacji: 2022-2026
Założenia projektu:
Coraz więcej badań wiąże rozwój endometriozy z upośledzeniem funkcjonowania układu immunologicznego, który w normalnych warunkach usuwa komórki ektopowego endometrium. U kobiet z endometriozą stwierdzono dysfunkcje licznych populacji komórek układu immunologicznego, takich jak limfocytów, makrofagów, komórek NK, itp. Znanym czynnikiem supresyjnym układu immunologicznego, szczególnie w mikrośrodowisku nowotworu, jest arginaza (ARG), jeden z enzymów metabolizmu aminokwasów. Niedawno stwierdziliśmy podwyższony poziom dwóch izoform arginazy, ARG1 i ARG2, oraz podwyższony poziom aktywności arginazy w surowicy pacjentek z endometriozą w porównaniu do zdrowych kobiet. W poprzednim projekcie wykazaliśmy immunosupresujne działanie egzosomalnej ARG1 w EVs. Tym samym odkryliśmy nowy mechanizm immunosupresji indukowanej przez nowotwór, bazujący na transporcie ARG1 przez mikropęcherzyki do lokalnych węzłów chłonnych, gdzie ten enzym blokuje aktywację i proliferację limfocytów T. Podobne, choć tylko przejściowe zahamowanie aktywności limfocytów T zaobserwowano w czasie cyklu menstruacyjnego oraz w ciąży w żeńskim układzie rozrodczym. Zahamowanie to korelowało z podwyższoną ekspresją ARG w tkance endometrium. Poza tym coraz więcej badań dowodzi, że analogicznie do roli EV w tworzeniu tzw. nisz metatatatycznych oraz organotropizmu przerzutów w rozwoju nowotworów, EV w mikrośrodowisku macicy i otrzewnej mogą wspomagać implementację i wzrost ektopowycjh komórek endometrialnych poza macicą. W związku z powyższym stawiamy hipotezę, że immunosupresyjny mechanizm wywoływany przez EVs zawierające ARG, podobny do opisanego przez nas w raku jajnika, może grać rolę także w rozwoju endometriozy i może być odpowiedzialny za obserwowane dysfunkcje różnych typów komórek układu immunologicznego.
Celem projektu jest identyfikacja zawierających arginazę mikropecherzyków zewnątrzkomórkowych w surowicy oraz w płynie otrzewnowym (PO) pacjentek z endometriozą, wyjaśnienie ich znaczenia w dysfunkcji układu immunologicznego oraz określenie ich potencjału diagnostycznego i prognostycznego w endometriozie. Bazując na naszym dotychczasowym doświadczeniu w badaniu EVs, zastosujemy najnowsze metody charakterystyki fenotypowej i funkcjonalnej EVs wyizolowanych z surowicy i PO i postaramy się odpowiedzieć na pytanie, czy profil EV znajdujących się w PO oraz ich poziom arginazy znajduje odzwierciedlenie w profilu EVs znajdujących się w krwi obwodowej. Jeśli tak, ten profil mógłby w przyszłości zostać wykorzystany do rozwoju klinicznego testu diagnostycznego. Określimy ponadto wpływ egzosomalnej ARG na wybrane typy komórek układu immunologicznego, jak cytotoksyczne limfocyty T, komórki NK i makrofagi, w funkcjonalnych hodowlach komórkowych.
Ponieważ egzosomalna ARG, tak jak pokazaliśmy to dla raka jajnika, jest bardziej stabilna, łatwo przenika bariery tkankowe i może być przenoszona na duże odległości, może wywierać ogólnoustrojowe efekty immunosupresyjne i znacząco przyczyniać się do wytworzenia korzystnej niszy dla zmian ektopowych i do rozwoju choroby. Tym samym wierzymy, że może być także bardziej znaczącym i wiarygodnym potencjalnym biomarkerem niż wolna arginaza. Poza tym arginaza jest obiecującym celem terapeutycznym, który już wszedł w fazę badań klinicznych w leczeniu nowotworów. Można założyć, że podobne opcje terapeutyczne staną się dostępne w leczeniu endometriozy, jeśli tylko rola arginazy w rozwoju tej choroby będzie potwierdzona. Uważamy, że ten projekt będzie pierwszym krokiem w tym kierunku.
Profil molekularny egzosomów znajdujących się w płynie z płukania oskrzelowo-pęcherzykowego jako nowy biomarker upośledzenia odpowiedzi immunologicznej w niedrobnokomórkowym raku płuca
Opus, Narodowe Centrum Nauki, lata realizacji: 2018-2022
Założenia projektu:
Dotychczasowe badania własne jak i innych naukowców niezbicie wskazują na kluczową rolę egzosomów, małych pęcherzyków błonowych wydzielanych przez różne typy komórek, w modulacji odpowiedzi immunologicznej skierowanej przeciw nowotworowi. Egzosomy, jako jeden z kluczowych elementów komunikacji międzykomórkowej zachodzącej w mikrośrodowisku guza i nośnik materiału genetycznego i funkcjonalnych cząsteczek supresyjnych pochodzących z guza, są istotnym mediatorem immunosupresji lokalnej jak i ogólnoustrojowej. Obecnie w licznych badaniach wykorzystuje się egzosomy pochodzące z krwi obwodowej jako łatwo dostępne źródło biomarkerów stanu immunologicznego pacjenta, umożliwiających dobór odpowiedniego leczenia jak i monitorowanie odpowiedzi organizmu na terapię. Jednakże zmiany wykryte w krwi obwodowej mogą nie odzwierciedlać istotnych z punktu widzenia terapii zmian w mikrośrodowisku nowotworu. Celem naszego projektu jest zbadanie, czy profil egzosomow z krwi obwodowej odzwierciedla profil egzosomów z mikrośrodowiska guza i może być rzeczywiście wyznacznikiem zmian w obrębie nowotworu.
Nowatorskim aspektem projektu będzie pozyskanie egzosomów z mikrośrodowiska guza z wykorzystaniem metody płukania oskrzelowopęcherzykowego. (ang. BAL). Jest to mało inwazyjny, wystandaryzowany zabieg możliwy do przeprowadzenia podczas rutynowej bronchofiberoskopii diagnostycznej wykonywanej u każdego pacjenta z podejrzeniem raka płuc. Planujemy dokonać kompleksowej oceny profilu molekularnego egzosomów obecnych w płynie z BAL w odniesieniu do stanu układu odporności w mikrośrodowisku guza u pacjentów z niedrobnokomórkowym rakiem płuca.
Spodziewamy się, że indywidualny profil molekularny egzosomów obecnych w mikrośrodowisku guza będzie znacząco wpływać na lokalną odpowiedź immunologiczną danego pacjenta jak i na efekt potencjalnej immunoterapii, co chcemy wykazać w mysim modelu raka płuca. Mamy nadzieję, że analiza molekularna i funkcjonalna egzosomów z BAL może przyczynić się do identyfikacji egzosomów jako markerów nowotworowych oraz stanowić cel dla nowatorskich strategii przeciwnowotworowych.
Zakończone projekty:
Zbadanie roli arginaz pochodzenia nowotworowego i egzosomalnego w unikaniu przeciwnowotworowej odpowiedzi immunologicznej w raku jajnika
Opus, Narodowe Centrum Nauki, lata realizacji: 2014-2018
W tym projekcie jako pierwsi wykazaliśmy, że małe mikropęcherzyki zawierające ARG1pełnią rolę w tworzeniu immunosupresyjnego mikrośrodowiska w raku jajnika. Arginaza 1 (ARG1) jest enzymem biorącym udział w metabolizmie aminokwasów. Pokazaliśmy, że małe mikropęcherzyki znajdujące się w płynie z otrzewnej i osoczu pacjentek z rakiem jajnika zawierają ARG1. Mikropęcherzyki te transportowały ARG1 z komórek nowotworowych do komórek prezentujących antygen w obwodowych narządach limfatycznych, gdzie hamowały swoistą proliferację i aktywację limfocytów. Wysoka ekspresja ARG1 w pierwotnych rakach jajnika oraz podwyższona aktywność enzymatyczna ARG1 w osoczu wiązała się z gorszym rokowaniem pacjentek z rakiem jajnika. W mysim modelu raka jajnika wykazaliśmy, że zablokowanie aktywności ARG1 specyficznym inhibitorem spowalnia rozwój nowotworu. Tym samym odkryliśmy nowy mechanizm ogólnoustrojowej supresji limfocytów T indukowanej przez nowotwór, bazujący na aktywności ARG1-pozytywnych mikropęcherzyków pochodzenia nowotworowego. Mechanizm ten może dotyczyć także innych typów nowotworów wytwarzających ARG1 i może mieć znaczące konsekwencje kliniczne dla podejmowanych prób immunoterapii nowotworów limfocytami T.
Publikacje:
Dlugolecka M, Szymanski J, Zareba L, Homoncik Z, Domagala-Kulawik J, Polubiec-Kownacka M, Czystowska-Kuzmicz M. Characterization of Extracellular Vesicles from Bronchoalveolar Lavage Fluid and Plasma of Patients with Lung Lesions Using Fluorescence Nanoparticle Tracking Analysis. Cells. 2021 Dec 9;10(12):3473. doi: 10.3390/cells10123473. PMID: 34943982; PMCID: PMC8699990.
Zareba L, Szymanski J, Homoncik Z, Czystowska-Kuzmicz M. EVs from BALF-Mediators of Inflammation and Potential Biomarkers in Lung Diseases. Int J Mol Sci. 2021 Apr 1;22(7):3651. doi: 10.3390/ijms22073651. PMID: 33915715; PMCID: PMC8036254.
Czystowska-Kuzmicz M, Whiteside TL. The potential role of tumor-derived exosomes in diagnosis, prognosis, and response to therapy in cancer. Expert Opin Biol Ther. 2021 Feb;21(2):241-258. doi: 10.1080/14712598.2020.1813276. Epub 2020 Sep 8. PMID: 32813990; PMCID: PMC7880862.
Czystowska-Kuzmicz M, Sosnowska A, Nowis D, Ramji K, Szajnik M, Chlebowska-Tuz J, Wolinska E, Gaj P, Grazul M, Pilch Z, Zerrouqi A, Graczyk-Jarzynka A, Soroczynska K, Cierniak S, Koktysz R, Elishaev E, Gruca S, Stefanowicz A, Blaszczyk R, Borek B, Gzik A, Whiteside T, Golab J. Small extracellular vesicles containing arginase-1 suppress T-cell responses and promote tumor growth in ovarian carcinoma. Nat Commun. 2019 Jul 5;10(1):3000
Sosnowska A, Czystowska-Kuzmicz M, Golab J. Extracellular vesicles released by ovarian carcinoma contain arginase 1 that mitigates antitumor immune response. Oncoimmunology. 2019 Aug 20;8(11):e1655370.
Szajnik M, Czystowska-Kuźmicz M, Elishaev E, Whiteside TL. Biological markers of prognosis, response to therapy and outcome in ovarian carcinoma. Expert RevMol Diagn. 2016 Aug;16(8):811-26.
Czystowska M, Gooding W, Szczepanski MJ, Lopez-Abaitero A, Ferris RL, Johnson JT, Whiteside TL. The immune signature of CD8(+)CCR7(+) T cells in the peripheral circulation associates with disease recurrence in patients with HNSCC. Clin Cancer Res. 2013 Feb 15;19(4):889-99
Rahma OE, Ashtar E, Czystowska M, Szajnik ME, Wieckowski E, Bernstein S, Herrin VE, Shams MA, Steinberg SM, Merino M, Gooding W, Visus C, Deleo AB, WolfJK, Bell JG, Berzofsky JA, Whiteside TL, Khleif SN. A gynecologic oncology group phase II trial of two p53 peptide vaccine approaches: subcutaneous injection and intravenous pulsed dendritic cells in high recurrence risk ovarian cancer patients. Cancer Immunol Immunother. 2012 Mar;61(3):373-84.
Czystowska M, Szczepanski MJ, Szajnik M, Quadrini K, Brandwein H, Hadden JW, Whiteside TL. Mechanisms of T-cell protection from death by IRX-2: a new immunotherapeutic. Cancer Immunol Immunother. 2011 Apr;60(4):495-506
Szajnik M, Czystowska M, Szczepanski MJ, Mandapathil M, Whiteside TL. Tumor-derived microvesicles induce, expand and up-regulate biological activities of human regulatory T cells (Treg). PLoS One. 2010 Jul 22;5(7):e11469.
Czystowska M, Strauss L, Bergmann C, Szajnik M, Rabinowich H, Whiteside TL. Reciprocal granzyme/perforin-mediated death of human regulatory and responder T cells is regulated by interleukin-2 (IL-2). J Mol Med (Berl). 2010
Mandapathil M, Hilldorfer B, Szczepanski MJ, Czystowska M, Szajnik M, Ren J, Lang S, Jackson EK, Gorelik E, Whiteside TL. Generation and accumulation of immunosuppressive adenosine by human CD4+CD25highFOXP3+ regulatory T cells. J Biol Chem. 2010 Mar 5;285(10):7176-86.